排雷攻略：一文教会你免疫组化、免疫荧光如何制片看片

最近带着新进门的研一师妹做实验，师妹问了三个问题：1、免疫组化和免疫荧光的区别？2、这两种实验该在什么情况下选择？3、组织是不是只能做免疫组化，细胞是不是只能做免疫荧光？4、免疫荧光为什么要做DAPI染色？我听完之后笑了，这种思考的态度是好的，但其实，师妹问的这几个问题就是一个问题。归根结底，涉及到“免疫”二字总是离不开抗原抗体反应的，二者都属于免疫检测技术手段，而免疫组化和免疫荧光两项技术都可以应用在组织和细胞方面，前者采用的是化学发光的方法，后者是荧光。因为我们在文献中看到的，很多人都会选择做组织的免疫组化、细胞的免疫荧光，所以这就给初入实验室的新手们带来了误区。

其实网上已经有很多详细的操作步骤，所以小六儿今天想为各位新手朋友们总结一下我认为的免疫组化和免疫荧光制片看片的小技巧，帮助大家排雷区，同时也提出自己的一些疑问，希望能得到解答（因为本人只做过组织的免疫组化和细胞的免疫荧光，以下内容以这两方面为主，内容若有欠缺，欢迎大家补充）。

• 免疫组化

1、  取材时要尽量去除血液的干扰：小鼠麻醉后，从左心耳插入针头，心尖处剪开一个小口，然后将PBS缓慢打入心脏中，缓慢跳动的心脏会将PBS运送至全身。50ml的PBS用量对于Balb/c或昆明小鼠的体积而言就已足够，这一步骤对于像肺、肝和脾脏这样血管丰富的脏器取材极为重要。

2、  取材时要尽量做到表面积大、厚度小：理想的取材厚度是2mm，这样的尺寸可以让后续的固定、脱水等操作达到理想的效果。器材选择上，手术刀和超市购买的刀片都可以，只要刀片锋利即可，切勿反复切割揉搓组织。因为脏器的表面都是弧形，并且质地很软，如果你直接取材，第一是不好切，第二是弧形的一面肯定是厚度超标，所以这里建议各位将组织置于碎冰上后，沿着长轴在横切面处再切一刀取材（针对实质性器官，且不要求取材部位）。

3、  取材后的组织需立即固定：固定不仅是要保留组织原有的形态，也是在保留组织中的抗原。组织离体取材后需立即固定，尽量不要超过20分钟。固定液的量一般为组织的5-10倍。

4、  抗原修复的条件极为重要：抗原修复是为了挽救在固定过程中被掩盖的一部分抗原特性，小六儿所在的实验室采用的是隔水加热的修复方法。将盛有修复液的广口容器放在电磁炉中加热至沸腾，然后将切片放入其中修复液中加热30分钟，修复液的量要保证完全覆盖切片，且不会蒸发至干涸，抗原修复过后要让其缓慢降至室温。抗原修复液多选择pH6.0的柠檬酸盐修复液，优点是染色背景较清晰，假阳性结果较少。

5、  设置对照实验：严谨的实验要求有阳性对照和阴性对照。这里的阳性对照和阴性对照和我们实验中比较的加药组和非加药组是两个概念，这是新手们容易误解的地方。我们在文献中很少看到阳性对照和阴性对照的图片，所以有很多同学在免疫组化实验中并不做这两组实验，这里还是建议，如果开启一个新的研究方向，对照组实验还是要做的，并且也有同学在投稿过程中要免疫组化对照组原始图片的情况，其重要性可见一斑。

6、  结果判读：对于免疫组化结果而言，最怕的就是不同的人看到的结果是不一样的。结果判读看重的主要是两点：

a、阳性结果。肉眼可见的阳性结果就是黄色深浅，但并不是说黄色就是阳性了。首先不排除组织本身自带的抗原表达情况，同时也有很大程度的假阳性结果的干扰，所以黄色要结合阳性和阴性对照而言，这也就回到上一条所说的，设置对照组的重要性！

b、阳性部位。蛋白的定位可以通过很多方式查询，包括文献、抗体说明书、专业网站（如the human protein atlas）等。

这里小六儿也想提出一点疑问，希望看到帖子的大神给予解答。肿瘤方面的研究，我们可以将正常组织和肿瘤组织作为阴性和阳性对照。那么我如果研究的炎症方面而并非某一种实质性的病变，是否可以只比较实验中的对照组和实验组中棕黄色的深浅呢？

如下图所示，研究EndMT在炎症中的作用，CD31作为血管内皮细胞的标志性蛋白，实验组CD31阳性结果明显减弱，重复三次以上实验后，是否就可以证明血管内皮标志性蛋白减少？

7、   常见问题处理办法：a)非特异性染色是最常见的问题，刨除目的蛋白的定位，其余部位仍显示黄色就可以判定片子出现了非特异性染色。非特异性染色出现的原因：EDTA或Tris作为抗原修复液、干片、抗体的选用以及封闭时间。如果不是特殊的目的蛋白，建议选用柠檬酸盐作为修复液，在保证制片过程中不出现干片的同时，适当延长封闭时间，并选用单克隆抗体。干片最容易造成非特异性染色，同样以CD31为例，主要位于血管内皮细胞的细胞膜上，但是在预实验的过程中发生了干片，右图所见胞质中仍然呈现浅棕色的结果。

b)实验组阳性结果不明显。一般情况下，免疫组化实验已经是在前期初步证明成功的选择，所以实验结果都会符合预期设想，那么如果阳性结果不明显，肯定是出在抗原修复不全、细胞通透不全或DAB孵育时间过短等操作问题上。

• 免疫荧光

在之前的分享中，我已经写过一些细胞免疫荧光实验过程中的操作技巧和后续的图像处理分析问题，今天这一趴主要讲一下细胞状态对于结果判定的重要性。

结果判断：免疫荧光的结果判定和免疫组化大致相同，细胞状态的好坏，加药处理前和加药处理后状态的好坏也是影响结果的关键。加药处理前的状态就不用说了，自己的细胞，状态什么样是最清楚的。如下图圈出的结果，未加药处理的细胞中，PECAM同样作为内皮细胞标志性蛋白，本应分布在细胞膜上的蛋白，但是对比DAPI结果发现，右侧细胞核皱缩，左侧细胞核也染上了红色。

那么加药处理后，有些细胞可能在中间就已经发生的程序性死亡。我们还是以CD31为例，左图DAPI染色可见明显的细胞核皱缩情况。我们想做的是EndMT（内皮间质转化），即内皮细胞向间充质细胞转型的过程，在这个过程中CD31表达减少。但是这张图可见，即便CD31染色减弱，从细胞核状态可见，这已经发生细胞程序性死亡，细胞皱缩；从右图可见，细胞形态变圆，也是程序性死亡的一种表现，所以即便染色程度减弱，这也是一个失败的实验。

所以这就是为什么免疫荧光一定要做DAPI染色。当然了这不是唯一的原因，但却是的它的必要性之一。

以上就是小六儿今天的分享，最近一直在补实验，感觉身体被掏空，如果内容有什么问题，欢迎大家批评指正！

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